xml地图

探索为什么单克隆抗体(mAbs)在对抗新型冠状病毒的战斗中至关重要,以及疫情如何影响了它们的发现和开发渠道。

三年来,新型冠状病毒肺炎(COVID-19)治疗药物研发取得实质性进展,疫苗接种一直处于抗疫的最前线。通过mRNA,疫苗促使你的细胞产生无害的刺突(Spike)蛋白,从而刺激免疫系统产生抗体来抵御潜在的威胁。而当前的问题是如果你已经感染了COVID-19,或者你的免疫系统受到损害,即使接种了疫苗也会有很高的住院风险。这就是需要单克隆抗体发挥作用的时候,在病毒侵入人体后,它可以靶向中和病毒。

为什么单克隆抗体对SARS-CoV-2有效?

单克隆抗体通过病毒中和作用来作用于病毒,它们之所以有效,是因为它们中断了病毒识别宿主或内化病毒的过程。

单克隆抗体的作用机制

在SARS-CoV-2中,单克隆抗体目的是破坏Spike蛋白与ACE2受体的结合,阻止病毒进入宿主细胞,Spike蛋白通过其结合结构域(RBD)介导结合,目前大多数中和性单克隆抗体都是针对RBD而产生。

对抗COVID-19变体,单克隆抗体的有效性如何?

在有效性方面,由于变体的数量不断增加,很难给出一个单一的答案。不同变体的疗效不同,例如,尽管大多数紧急使用授权抗体对α和δ变体有效,但对Omicron变体的疗效较低。

Omicron面临的挑战是Spike蛋白上至少有36个突变,其中一些位于RBD。这些突变导致差异糖基化,使病毒能够避开先前形成的免疫应答或单克隆抗体中和。

幸运的是,较新的抗体如Sotrovimab,在最近的变体中设法保留了它们的中和活性,所以仍然有一线希望,然而疗效可能会有很大差异,一些抗体对α和β变体非常有效,但对γ或δ变体无效。相比之下,对δ和α有效的抗体对β、γ和Omicron变体的效果要差得多。特定变异突变对EC50的影响取决于突变是否位于结合表位。

单克隆抗体优于其他新冠肺炎疗法的优势

确定剂量水平是单克隆抗体在新冠肺炎治疗中的主要优势之一。

根据Madasu博士的说法,恢复期血浆疗法的成功率在很大程度上取决于捐赠者。Madasu进一步解释说:“在恢复期血浆疗法中,A)你期望供体仍能产生中和抗体,B)供体产生的量足以有效。使用单克隆抗体,我们可以准确地知道我们给病人注射了多少中和抗体,这是一个巨大的优势。”

恢复期血浆治疗会存在患者血浆不相容的重大风险,使用单克隆抗体作为有效的新冠肺炎治疗方法可显著降低这些风险。

Mitchell博士强调了单克隆抗体治疗的另一个值得注意的特点,即能够产生一种假多克隆混合物亚群,这种混合物可以中和任何未来可能出现的变体。有人可能会问:我们怎么能如此肯定这些抗体会对未来的变体有效?由于每个亚群都有特定的结合表位,因此突变可以被一个或多个mAb亚群快速识别。

Mitchell博士举例道:“五年后,如果一种新型变异体出现,我们可能能够使用针对2023年出现的野生型PLUS的单克隆抗体作为联合疗法,对这种特殊变异体产生更大的疗效。”

新冠疫情大流行的影响

目前单克隆抗体技术一直在发展中,而如果没有新冠疫情,单克隆抗体生产的技术仍会取得进步吗?

尽管已经建立了单克隆抗体的研发过程,但疫情仍会给与我们一种紧迫感。Madasu博士还认为,与疫苗相比,人们对抗体疗法的理解更容易/更好。在疫情的早期阶段因对疫苗的有效性不是很了解,因此有些人可能对接种疫苗犹豫不决。另一方面,人们对抗体有了更深的理解,因此基于抗体的疗法被更广泛地接受。 

疫情不仅加速了现有策略的改进,还促进了新技术的发展。诸如高通量表面等离子体共振(SPR)、高通量生物层干涉测量(BLI)等技术在疫情期间引起了人们的兴趣。此外,高通量动态光散射(DLS)和FLD也有很大的进步。而较新的技术之一是基于人工智能的De Novo单克隆抗体设计,它提高了抗体发现平台的速度和复杂性。

COVID-19单克隆抗体工作流程

构建工作流程的第一步是选择用于开发单克隆抗体的抗原。在初始阶段,免疫是通过将抗原给药于产生免疫反应的动物而发生的。然后分离动物免疫反应期间产生的B细胞,接着与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。

根据Mitchell博士的说法,成功的初始阶段的关键是抗原的优化。“在新冠肺炎的情况下,抗体主要针对刺突蛋白,这是一种三聚体。刺突蛋白具有形成高分子量聚集体的倾向,这对于免疫策略可能不是很好”。 

此外,刺突蛋白的糖基化模式在不同细胞类型之间差异很大,更不用说不同物种了。 

这就是为什么我们必须非常小心地选择抗原。即使单个抗原聚糖(例如在不同的变体中)的轻微偏差也会显著影响抗体的成功率。

挑战和瓶颈

免疫接种

目前一个主要的挑战是对病毒基因组的了解,研究团队通常必须合成和纯化抗原,并优化它们的表达。然而,为了评估表达和纯化的成功程度,他们不得不依靠科学家的合作来发布来自他们自己实验室的信息。总的来说,动物的免疫和杂交瘤的产生可能需要长达8周的时间。

单细胞分离

在确定免疫策略的最佳质量抗原后,下一个挑战是获得足够数量的B细胞以进行杂交瘤的单细胞分离。 

培养这些杂交瘤的传统方法是使用半固体培养基,使单细胞形成克隆。这过去是一个缓慢的过程,但后来随着自动化仪器的出现,这一过程得到了发展,自动化仪器允许在微孔板的每个孔中打印单个细胞,从而提高了产量和效率。 

需要注意的是,先进的单细胞分离工具还可提高克隆生长效率,并可验证克隆是否来自单细胞。

大规模单克隆性

对于大规模单克隆性,需要产生重组形式的单细胞分离杂交瘤,因为单细胞分离不足以产生临床相关的mAb。临床试验的批准将需要重组产生单克隆抗体,将其制成可产生适当免疫反应的人抗体。

为了形成稳定的细胞系以产生足够浓度的单克隆抗体,您需要对基因进行测序和改造,使其成为人类构建体。使用CHO细胞系进行重组产生,目的是产生8-20 g/L的mAb。

时间和资金限制

时间和成本是mAb工作流中需要考虑的关键因素

虽然稳定克隆的产生可以在最初培养后12天内实现,但是用传统的克隆方法,完全的单克隆保证可能需要长达6个月。更重要的是,生产一个完全实现的mAb结构可能是昂贵的。解决办法是形成单链可变片段抗体或VHH纳米抗体,这些是可能表现出对抗原的特异性结合亲和力的最小抗体片段,Mitchell博士总结了这种方法如此强大的原因:

“通过将单克隆抗体转化为更小的纳米抗体,我们可以在大肠杆菌中以更具成本效益的方式生产它们。这降低了成本从而使其成为一种广泛适用的疗法,而不是那些只有在发达国家才能获得的疗法。”

根据Madasu博士的说法,它们稳定的结构使得向发展中国家的分销更加容易。“我们需要考虑其他无法获得存储设施的发展中国家。其中一些纳米抗体非常稳定,可以在不太严格的条件下储存。”

显然,抗体到纳米抗体的转化是以较低成本在全球推广基于单克隆抗体的疗法的关键一步。尤其是在储存设施不足的发展中国家,纳米体在极端温度下仍能保持稳定。

确保单克隆性,自动化加速COVID-19单抗的生产

单克隆性保证

确保大规模单克隆的方法包括单细胞打印或克隆采集等自动化技术。当从HAT培养基中挑选一个单克隆时,该仪器在挑选克隆后从第0天开始的一段时间内拍摄图像,拍摄的图片可成为单克隆性的证据。为了确保高性能克隆,实验室可以使用基于细胞或基于免疫的检测结合基于图像的方法。这种组合策略可确保您的克隆具有单克隆性,并且正在分泌单一种类的抗体。作为该过程的最后一步,进行表位结合实验也有助于判断表位结合是否均匀。

自动化的作用

缩短开发时间的最终方法是实现高通量的自动化仪器来验证克隆。在新冠肺炎的自动化mAb工作流程中,自动化纯化为了解克隆的行为以及单克隆抗体生成高分子量聚集体的可能性提供了很大的帮助。 

用自动化仪器实现高通量一直是将新疗法推向市场的优势。这种方法能更好的概述蛋白质空间或表位空间。拥有大量的克隆可以最大限度地增加获得覆盖所有所需属性的单克隆抗体的机会,而不是只有一个覆盖部分抗原的单克隆抗体。

通过高通量工作流,可以将关注点缩小到产量最高的单克隆亚群。然后,您可以继续使用排名最高的亚群进行进一步的动物研究和毒理学测试评估。您还可以通过消除不适合大规模纯化的亚群来节省时间,这可以防止实验室新冠肺炎研究期间的资金流失。

未来单克隆抗体实验室流程的自动化

许多新冠肺炎研究实验室已经实现了自动化过程,因为他们每周能够生成数千个克隆的数据。自动化合成、表达、纯化和生物物理表征更有可能理解单克隆抗体的治疗机制。 

更重要的是,自动化为无偏见的分析方法和选择标准铺平了道路。客观分析对于使抗体库多样化以用于广泛的变体和突变是必要的,以避免扩大只能治疗一小部分变异的抗体。

SARS-CoV-2的研究前景及单克隆抗体的作用

自1986年以来,基于单克隆抗体的疗法已在美国市场上市,FDA首次批准开发muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3)单克隆抗体,以减少器官移植患者的急性排斥反应。(1)当前的新冠肺炎研究也增加了单克隆抗体在诊断学中的重要性。事实上,单克隆抗体在检测新型冠状病毒变异中发挥了重要作用。

除了诊断之外,目前的单克隆抗体有助于研究人员确定必要的修饰,甚至为候选疫苗的开发提供信息。在研究参考单克隆抗体是否可以中和病毒变异体时,研究人员可以决定是否开发更有效的新疗法。

虽然基于mRNA的疫苗一直是抗击新冠肺炎的核心,但单克隆抗体一直在推动各种应用的发展,从基于蛋白质的疫苗到基于抗体的治疗。 

Madasu博士和Mitchell博士认为,未来单克隆抗体可以特别地应用于未接种疫苗的人群,包括婴儿、并发症患者(对疫苗反应不佳)和犹豫是否接种疫苗的人。如前所述,关键是通过提高发现和生产过程的效率,生产出具有成本效益的基于单克隆抗体的疗法,并使它们尽可能广泛地使用。

使用Molecular Devices的实验室自动化解决方案开发COVID-19单克隆抗体

克隆筛选是单克隆抗体发现的瓶颈之一,因为您必须测试和分析成千上万个与靶抗原相关的细胞。通过减少实际操作时间并统一和标准化从多个流程中提取的数据,自动化克隆筛选工作流程可以帮助克服这一困难。 

Molecular Devices为基本步骤构建了集成的工作流程解决方案。自动化细胞株开发工作流程旨在生产能够产生一致且足够水平的目标治疗性蛋白质的单克隆细胞系。自动化分子克隆工作流程旨在最大限度地减少DNA序列分离过程中的错误和污染,DNA序列作为载体转入到您选择的物种中。 

这些工作流程最大限度地提高了目标蛋白质的产量,同时可以将自动化仪器整合在一起。总的来说,这样的工作流程具有成本效益,节省时间,并且易于根据不断变化的研究目标进行更改。 

Wang, S. S., Yan, Y. S., & Ho, K. (2021). US FDA-approved therapeutic antibodies with high-concentration formulation: summaries and perspectives. Antibody therapeutics, 4(4), 262–272. 

更多详情请关注Molecular Devices美谷分子仪器官网